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干货 | qPCR 实验中关于 CT 值问题的详细攻略(下)

作者:admin      发布时间:2019-11-08 14:00:20      阅读次数:19

CT 值很大怎么办?


造成 C值偏大的因素较多,主要分为以下两大类情况:


(1)相同体系,前期实验 C值正常,本次实验,所有基因扩增 C值皆偏大。


这种情况下,需要排查 RNA 是否存在降解。如何判定 RNA 是否存在降解呢?可通过 1% 的琼脂糖凝胶电泳进行检测。


完整度好的 RNA 是有三条带的,以真核生物为例,三条带分别是 28s、18s、5s,且 28s 条带的亮度是 18s 的两倍,5s 最暗(下图左)。


如果 RNA 发生降解,会出现三条带的亮度发生变化,甚至不存在完整的三条带。如果 28s 几乎看不到了,整个泳道 Smear 严重,说明 RNA 的降解已经很严重了,此时 RNA 不建议用作后续的逆转录实验(下图右)。重新提取 RNA 重复实验。


image.png


(2)该基因第一次扩增,其 C值偏大,而其余基因的 C值正常。


这种情况下就需要判定是因为基因的扩增效率低导致的 C值偏大,还是基因本身的表达量低造成的 C值偏大。


如何判定是因为基因的扩增效率低导致的 C值偏大,还是基因本身的表达量低造成的 C值偏大呢?首先需要计算引物的扩增效率。


可将基因的扩增产物进行梯度稀释(至少三个梯度,且梯度之间的 △C均一,防止因为操作原因导致标准曲线线性关系差,进而影响扩增效率的计算),同时进行 qPCR。将得到的标准曲线进行引物扩增效率的计算。


关于引物扩增效率的计算,可参考下面的案例:


① qPCR 扩增:


将 qPCR 产物进行原液、1/10、1/100 梯度稀释,每个梯度设置三个复孔,进行 qPCR 扩增,复孔间 C值取平均值,得到三组 C值。


image.png


② 标准曲线绘制及扩增效率计算:


可以在 excel 上进行扩增效率的计算。稀释梯度可以设置为 -1、-2、-3,每个梯度对应的 CT 值分别为 23.69、27.04、30.27,如下图,进行标准曲线绘制。


通过标准曲线可以得到线性方程(y = -3.29 x + 20.42)与 R2 值(R2 = 0.9999)。将线性方程得到的斜率(-3.29)带入扩增效率计算公式中image.png:,即可得到扩增效率:101.35%。


image.png


只有当扩增效率满足 90~120%,且标准曲线 R2 ≥ 0.99,引物的扩增效率才是合格的,定量出来的 C值才可以用来计算。且扩增效率越接近 100%,引物的扩增性能越优。


  1. 若扩增效率不满足 90~120%,那 C值偏大是因为扩增效率不达标导致的,需要重新设计引物。

  2. 若引物的扩增效率满足 90~120% 前提下,C值仍然很大,则是基因本身表达量低造成的 C值偏大,可以提高模板的添加量,但最根本的方法是改为探针法进行定量。探针法的灵敏度是高于染料法的。

转自:诺唯赞

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