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干货 | qPCR 实验中关于 CT 值问题的详细攻略(上)

作者:admin      发布时间:2019-11-05 09:45:35      阅读次数:25

qPCR 实验在分析 C时常常遇到这几类问题,比如:


  • 复孔间重复性差,是否都和操作有关?

  • 无模板阴性对照出现 C值时,目的基因的 C值是否还能用?

  • C值很大该怎么办?


今天就给大家分享下,在 qPCR 实验中遇到关于 C值的常见问题时该如何解决。


复孔间重复性差怎么办?


复孔间重复性差一般会有以下两种情况:


(1)C值很大,如 C≥ 30,重复性差属于正常现象。该现象符合泊松分布,即在有效模板量很少的情况下,模板与引物的碰撞存在随机性,直接导致复孔间的 C值差异较大。


image.png


解决方法:如果融解曲线没有杂峰,无模板阴性对照同目的基因的 △C值为 3 or 5 以上,那 C值为准确的,可多设置几个复孔,选择重复性好的 C值参与计算。


(2)C<30,重复性较差。这种情况一般同操作有关。


image.png


解决办法:从以下几个方面进行问题的排查:① 加样准确度;② 移液器吸取液体的准确度;③ 定期校准 qPCR 仪。


① 加样准确度


  • 避免小体积加样,减少加样误差。可以将引物、SYBR Green Mix、ddH2O 配置成混合体系,并且增加模板的稀释梯度,大体积加样。如:原液 cDNA 添加 1 μL,可以更改为原液 cDNA 稀释 5 倍,添加 5 μL,使用 ddH2O 补齐体系至 20 μL 即可。

  • SYBR Green Mix、配置的混合体系需要混合均匀。从 -20 ℃ 冰箱拿出的试剂需要完全融化并上下颠倒彻底混匀;配置体系时,将混在一起的 Mix 用移液器吹打混匀。


② 移液器吸取液体的准确度


  • 移液器量程定期校准,校准周期为 1 年。

  • 购买与移液器配套的枪头,若枪头与移液器不匹配,在吸取液体时易出现漏气的现象,导致吸取量程不准确。

  • 在吸取相同量程的液体体积时,注意观察每次吸取液体在枪头内的液面高度是否一致。


③ 定期校准 qPCR 仪


  • 一般 qPCR 仪校准周期为一年。



未完待续...

转自:诺唯赞

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